什么是熒光定量PCR?

更新時(shí)間：2024-12-04

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time qPCR）是指在PCR反應中加入熒光基團，通過(guò)連續監測熒光信號出現的先后順序以及信號強弱的變化，即時(shí)分析目的基因的初始量的一種PCR技術(shù)。

一、熒光化學(xué)物質(zhì)

Real-time qPCR所使用熒光化學(xué)物質(zhì)有熒光染料和熒光探針兩類(lèi)。

1、熒光染料

目前主要使用的熒光染料是SYBR Green I，SYBR Green I是一種嵌入型花箐染料，在488nm（藍光）照射激發(fā)后，在522nm（綠光）具有發(fā)射高峰。

SYBR Green I是嵌在DNA螺旋的小溝里面的，一般用來(lái)染雙鏈DNA，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關(guān)，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

YBR Green I 與雙鏈DNA的親和力非常高，對分子生物學(xué)中常用的酶（如：Taq 酶、逆轉錄酶、內切酶、T4連接酶等）沒(méi)有抑制作用。

SYBR染料-DNA復合物在非極性溶液中可解離，可用乙醇沉淀的方法將SYBR Green I 從DNA中去除。SYBR Green I能夠被玻璃表面強烈吸收，染料溶液應該在塑料容器中配制。

SYBR Green I 染料法即將SYBR Green I染料添加到PCR反應體系中時(shí)，SYBR Green I能夠結合到模板和擴增產(chǎn)物發(fā)出熒光；隨著(zhù)每輪擴增，產(chǎn)物量呈指數型上升，熒光信號也隨之累積并被儀器檢測到。

2、熒光探針

Real-time qPCR中常用的熒光探針為T(mén)aqMan探針，其基本原理是依據目的基因設計合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的FRET探針，該探針的5'端標記熒光基團，3'端標記淬滅基團。正常情況下兩個(gè)基團的空間距離很近，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收而不能發(fā)出熒光；PCR擴增時(shí)，引物與該探針同時(shí)結合到模板上，探針的結合位置位于上下游引物之間；當擴增延伸到探針結合的位置時(shí)，PCR酶利用5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而使其發(fā)出熒光。

熒光信號被熒光監測系統接收，檢測到的熒光分子數與PCR產(chǎn)物的數量成正比，因此，根據PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數量。

1）熒光共振能量轉移FRET

熒光共振能量轉移是指在兩個(gè)不同的熒光基團中，如果一個(gè)熒光基團（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個(gè)熒光基團間的距離臨近至一定范圍時(shí)（一般小于100?／10nm），就可觀(guān)察到熒光能量由供體向受體轉移的現象，即以前一種熒光基團的激發(fā)波長(cháng)激發(fā)時(shí)，可觀(guān)察到后一個(gè)基團發(fā)射的熒光。

簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是在供體基團吸收一定頻率的光子后第一電子發(fā)生能級躍遷被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過(guò)偶極子相互作用，實(shí)現了能量向鄰近的受體分子轉移的過(guò)程。

此過(guò)程沒(méi)有光子的參與，所以是非輻射的，供體分子被激發(fā)后，當受體分子與供體分子相距一定距離，且供體和受體的基態(tài)及第一電子激發(fā)態(tài)兩者的振動(dòng)能級間的能量差相互適應時(shí)（同一振蕩頻率），處于激發(fā)態(tài)的供體將把一部分或全部能量轉移給受體，使受體被激發(fā)，在整個(gè)能量轉移過(guò)程中，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能量轉移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現出受體的熒光，并造成次級熒光光譜的紅移。

①FRET發(fā)生條件：

a.供體分子的發(fā)射光譜應與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著(zhù)重疊（＞30%）。

b.供體分子與受體分子的作用距離必須在1-10nm之間，基團間的FRET效率可由E=1/［1+(R/R0)?］反映（R表示基團分子之間的距離；R0表示E=50%時(shí)供體和受體分子間的距離，依賴(lài)熒光基團發(fā)射譜和淬滅基團激發(fā)譜的重疊程度以及基團能量轉移的偶極子的相對方位，對于特定的供體受體對是常數）。

FRET程度與基團之間的空間距離緊密相關(guān)，隨著(zhù)距離延長(cháng)，FRET呈顯著(zhù)減弱。

c.供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量必須滿(mǎn)足一定的條件。

②FRET的應用

a.檢測分子間相互作用：

b.檢測分子的折疊與構像變化：

2）TaqMan探針

①設計原則：

a.長(cháng)度：建議15-30bp，以保證結合特異性；擴增子長(cháng)度應小于150 bp。

b.Tm值：68-72℃，高于引物8-10℃，可保證探針在退火時(shí)先于引物與目的片段結合，也確保探針與模板結合的穩定性大于引物與模板結合的穩定性，最好富含GC。

c.5'端／3'端：探針5'端避免為G，G堿基一定程度上對5'端熒光有淬滅作用，避免報告基團的熒光在探針切割后發(fā)生淬滅；3'端需進(jìn)行封閉，以防止在PCR中起引物的作用進(jìn)行延伸，TAMRA等基團本身可進(jìn)行封閉。

d.堿基分布：GC含量在30%~80%之間，一條探針中，C含量多于G，G含量高會(huì )降低反應效率，這時(shí)可選擇互補的另一條鏈作為探針，避免單個(gè)核苷酸成串，如GGGGG。

e.結合位置：探針退火時(shí)，應盡可能接近上游引物，同時(shí)又不重疊，離上游引物的3'端至少相差一個(gè)堿基；如果Taqman探針是用于檢測等位基因或突變位點(diǎn),則應將錯配核苷酸放在探針中間，不能放在末端。

e.純化方式：建議選擇HPLC純化。

②保存：TaqMan探針必須避光保存，避免熒光基團降解。

3）TaqMan探針?lè )▋?yōu)點(diǎn)

①特異性強：

探針?lè )╭PCR要達到檢測的目的，不僅要上下游引物要跟模板匹配，還需要探針與模板匹配，提升了檢測的特異性。另外一方面，對于模板同源性比較高的不同目的基因的檢測和鑒定，在擴增引物特異性沒(méi)法保證的情況下，可通過(guò)設計探針的特異性來(lái)達到特異性檢測的目的。而且特異性的探針比特異性的引物對模板序列的特異性要求要低，只要模板有幾個(gè)堿基甚至1個(gè)堿基的差異就能設計特異性的探針，而這對于擴增引物是無(wú)法實(shí)現的。

②準確性、靈敏度高：

從探針?lè )╭PCR原理來(lái)看，擴增引物和探針序列都匹配后擴增的產(chǎn)物才能產(chǎn)生熒光信號，這樣就確保了熒光信號是目的片段的擴增產(chǎn)生的，排除了非特異性擴增的影響，從而保證了檢測的準確性。特別是針對一些低拷貝和低濃度的樣品，染料法qPCR隨著(zhù)循環(huán)數的增加容易出現引物二聚體的信號干擾，導致檢測結果不準，而這種情況在探針?lè )╭PCR上不存在，因為即使出現引物二聚體，由于其不是目的片段，沒(méi)有探針結合位點(diǎn)，所以也不會(huì )產(chǎn)生熒光信號。這也體現了探針?lè )╭PCR檢測低拷貝樣品的高準確性和高靈敏度。

③可進(jìn)行多重檢測：

在探針的5'端標記不同的熒光修飾，則不同的探針在檢測過(guò)程中就會(huì )發(fā)出不同的熒光信號。根據此原理，可以將檢測不同目的基因或者基因型的探針標記不同的熒光修飾，用做混合檢測，這樣就可以做多重檢測，檢測對應的熒光信號就是檢測對應探針的熒光定量結果，多重檢測大大節省檢測成本和檢測時(shí)間，進(jìn)一步提高了檢測的速度和適用性。

二、定量原理

理想的PCR反應：X＝X?*2?；實(shí)際的PCR反應：X＝X?*(1＋Ex)?（n：擴增反應的循環(huán)次數，X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量，X?：初始模板量，Ex：擴增效率）；在擴增產(chǎn)物達到閾值線(xiàn)時(shí)：XCt＝X?*(1＋Ex)??＝S （XCt：熒光擴增信號達到閾值強度時(shí)擴增產(chǎn)物的量，在閾值線(xiàn)設定以后，它是一個(gè)常數，設為S）；方程式兩邊同時(shí)取對數得: lgS＝lg［X?*(1＋Ex)??］，整理方程式得: lgX?＝-lg(1＋Ex) ??＋lgS。

結論：

①模板DNA量越多，達到熒光閾值的循環(huán)數越少，即Ct值越小。

②lg濃度與循環(huán)數呈線(xiàn)性關(guān)系。

a. 根據樣品擴增達到閾值的循環(huán)數（Ct值）即可計算出樣品中所含的模板量。(相對定量)

b. 通過(guò)已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線(xiàn)，根據樣品Ct值，即可計算出樣品中所含的模板量。（絕對定量）

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